이번 글에서는 Oxford Nanopore를 이용한 플라스미드 plasmid 시퀀싱에 대해 알아보고자 한다.

세포를 구성하는 유전물질인 핵산을 구성하는 것이 DNA와 RNA의 서열 분석을 위해 사용하는 3세대 시퀀싱 기술이 나노포어 시퀀싱이다.

이 시퀀싱으로 기존에 사용하는 중합효소 기반의 증폭 반응이나, 시료를 화학적으로 표지하지 않고 DNA와 RNA라는 핵산을 구성하는 단일 분자를 분석할 수 있다.

또한 나노포어 시퀀싱은 핵산의 유전자를 분석하고 이동하기 편하며, 무엇보다 결과를 실시간으로 분석할 수 있다. 따라서 시료를 신속하게 분석해야 하는 분야에 적용하기에 적합하다.

나노포어 시퀀싱을 이용하여 바이러스 병원체를 빠르게 식별하고, 에볼라를 모니터링 하거나, 환경 분석, 인간과 식물의 게놈의 서열을 분석하거나, 항생제의 내성을 확인하는 것과 같은 다양하게 적용이 가능한 것으로 알려져 있다.

쉬운 목차

1. Nanopore 시퀀싱을 이용한 플라스미드 시퀀싱의 장점

정확하고 짧은 시간 내에 서열 확인 가능한 Nanopore 시쿼싱

Nanopore 시퀀싱을 이용한 플라스미드 시퀀싱은 몇 가지 장점이 있기에 최근 각광 받고 있다. 실험실에서 전체 길이 플라스미드의 매우 정확하고 유연하며 안전한 특성화를 가능하게 하며 결과를 몇 시간 내에 얻을 수 있으므로 검증을 위해 시료를 시퀀싱 분석 회사로 보낼 필요가 없다. 이는 기존의 모세관 기반 플라스미드 시퀀싱 옵션에 대한 비용 효율적인 대안이 될 수 있다.

플라스미드 시퀀싱에 Nanopore 시퀀싱을 사용할 때의 장점 중 하나는 순수 플라스미드 콜리니의 정체를 확인할 수 있다는 것이다. 이를 통해 알려지고 예상되는 시퀀스와 일치하는지 확인하거나 존재하는 경우 플라스미드에 존재하는 돌연변이를 식별할 수 있다. 이것은 중요한 시약 또는 치료제로 사용되는 플라스미드를 확인하는 데 필수적이다.

2. Nanopore 시퀀싱을 이용한 플라스미드 시퀀싱의 단점

낮은 처리량과 고비용

그러나 플라스미드 시퀀싱에 Nanopore 시퀀싱을 사용할 때의 한 가지 단점은 다른 긴 판독 기반 방법만큼 처리량이 높거나 비용이 저렴하지 않을 수 있다는 점이다. 또한 플라스미드의 임상 등급 시퀀싱을 아웃소싱하는 것과 비교하여 상당한 비용 절감을 제공할 수 있지만 여전히 일부 예산이 허용하는 것보다 더 비쌀 수 있다.

요약하면, Nanopore 시퀀싱은 정확성, 유연성 및 속도를 비롯한 여러 장점을 제공하는 플라스미드 시퀀싱의 최근 경향이다. 그러나 다른 긴 읽기 기반 방법만큼 처리량이 높거나 비용이 저렴하지 않을 수 있다.

3. 관련 논문

short-read 시퀀싱 없이 완전한 박테리아 및 플라스미드 게놈 분석 가능

Oxford nanopore long-read 시퀀싱을 통해 short-read 시퀀싱 없이 완전한 박테리아 및 플라스미드 게놈 생성 가능 (Oxford nanopore long-read sequencing enables the generation of complete bacterial and plasmid genomes without short-read sequencing)

게놈 기반 분석은 항생제 내성 박테리아(antibiotic-resistant bacteria, ARB) 및 항생제 내성 유전자(ntibiotic-resistance genes, ARG)를 모니터링하는 데 중요할 것이다. Short-read 시퀀싱은 일반적으로 불완전한 드래프트 게놈을 얻는 데 사용되는 반면 long-read 시퀀싱은 다제 내성(multidrug resistance, MDR) 플라스미드의 게놈을 얻고 박테리아에서 플라스미드 기반 항균 저항 유전자의 전달을 추적할 수 있다. 그러나 long-read 시퀀싱은 정확도가 낮은 base calls로 인해 어려움을 겪고 있으며 short-read 시퀀싱은 게놈 정확도를 향상시키기 위해 종종 필요하다. 이는 비용과 처리 시간을 증가시킨다.

이 연구에서는 오랫동안 읽은 시퀀싱 데이터에서만 MDR 균주 및 플라스미드의 게놈을 조립하기 위해 정확도가 향상된 최신 ONT 화학을 사용하는 새로운 ONT 시퀀싱 방법을 보여준다. MDR 플라스미드를 보유하는 Salmonella의 3개 균주는 유동 셀 R10.4.1이 있는 ONT SQK-LSK114 키트를 사용하여 시퀀싱되었으며, de novo 게놈 어셈블리는 98.9%의 평균 판독 정확도(Q > 10)로 수행되었다.

5Mb 길이의 박테리아 게놈의 경우 Flye 및 Medaka 소프트웨어를 사용하여 75배 시퀀싱 커버리지 깊이에서 >99.99%의 정확도로 완성된 게놈 시퀀스를 얻을 수 있다. 따라서 이 새로운 ONT 방법은 base-calling 정확도를 크게 향상시켜 short-read 시퀀싱 없이 고품질의 완성된 박테리아 또는 플라스미드 게놈의 de novo 어셈블리를 허용한다. 이는 비용과 시간을 모두 절약하고 중요한 게놈 기반 역학 분석에서 ONT 데이터의 적용을 지원한다.

이번 연구에서 설명된 새로운 ONT 접근 방식은 short-and-long-read 시퀀싱을 기반으로 하는 전통적인 조합 게놈 어셈블리를 대신할 수 있으며, 고품질의 완전한 박테리아 및 플라스미드 게놈을 기반으로 하는 게놈 분석을 통해 항생제 내성 박테리아 및 항생제 내성 유전자의 확산을 모니터링할 수 있을 것이다.

Keywords: ONT sequencing, 정확도, complete genome, bacteria, plasmid