계속해서 초이는 프라이머 디자인primer design을 해서 프라이머가 사용되는 경우를 설명해 주었다.
초이는 먼저, PCR이라고 하는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)에
다양한 주형이라고 부르는 템플릿 template이 사용될 수 있다고 덧붙였다.
PCR에서 주형(template)은 증폭되는 DNA 서열이다. 프라이머 결합 부위와 PCR의 시작점을 제공한다. 증폭은 내열성 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 이루어진다. Genomic DNA, plasmid DNA, cDNA 또는 정제된 PCR 제품은 PCR에서 템플릿 DNA로 사용할 수 있다. 주형 DNA의 농도는 우수한 PCR 증폭을 달성하는 데 중요한 역할을 하지만 필요한 요구 사항과 특이성에 따라 달라진다. 주형 DNA의 이상적인 농도는 반응당 10~100ng이 적절한 것으로 알려져 있다.
template의 종류
1. 게놈 DNA (gDNA)인 경우: PCR, ChIP (chromatin imunoprecipitation), Methylation-specific PCR(MS-PCR) 등
2. mRNA 인 경우 cDNA로 전환되어 사용: RT-PCR, real-time PCR 등
3. 마이크로 알앤에이 (MicroRNA): real-time PCR 등
여기에서 말하는 PCR은?
분자 생물학에서 사용되는 기술 중 하나로, DNA의 특정 부분을 복사하기 위해 특정 DNA 서열을 증폭하거나 복제할 수 있는 분자 복사기처럼 과학자들이 특정 부분을 연구하고 분석하는 것을 지원하는 유용한 기술이다.
PCR은 아래와 같은 과정으로 이루어져 있다.
PCR에 필요한 재료는 아래와 같다.
a. 템플릿 DNA: 복사하려는 DNA 샘플로 인체 세포, 박테리아 또는 식물에서 비롯한다.
b. 프라이머: 증폭하려는 표적 DNA 영역에 결합하도록 특별히 설계된 짧은 DNA 서열이다. 이들은 DNA 합성의 출발점 역할을 한다
c. DNA 중합효소: 이것은 특수한 효소로 새로운 DNA 염기를 추가하고 새로운 DNA 가닥을 만들 수 있다.
d 뉴클레오티드: 이들은 DNA의 빌딩 블록으로 PCR 중에 새로운 DNA 가닥에 통합될 개별 염기(A, T, C 및 G)를 말한다.
e. 완충액: PCR 반응이 일어나기 위한 최적의 조건 (염 농도, pH 등)을 제공한다.
PCR 단계는 크게 3단계로 이루어진다.
a. 변성 denaturation: 첫 번째 단계는 PCR 혼합물을 고온(약 95°C)으로 가열하는 것입니다. 이렇게 하면 주형 DNA의 두 가닥을 함께 묶고 있는 수소 결합이 끊어져 단일 가닥으로 분리됩니다.
b. 어닐링 annealing: 그런 다음 프라이머가 주형 DNA의 상보적 서열에 결합할 수 있도록 온도를 낮춥니다. 이 단계는 일반적으로 약 55-65°C의 온도에서 수행됩니다. 프라이머는 각 단일 가닥에 하나씩 주형 DNA의 특정 표적 영역에 결합합니다.
c. 확장 extension: DNA 중합효소가 작동하는 최적의 온도인 약 72°C까지 온도를 높입니다. DNA 폴리머라제 효소는 프라이머에 뉴클레오티드를 추가하기 시작하여 보완적인 방식으로 DNA 가닥을 확장합니다. 이 프로세스는 전체 대상 영역이 복사될 때까지 계속됩니다.
이 세 단계(변성, 어닐링 및 확장)가 PCR의 한 주기를 구성합니다. 그런 다음 표적 DNA를 기하급수적으로 증폭하기 위해 여러 주기를 반복합니다. 각 주기는 DNA의 양을 두 배로 늘리므로 30주기 후에 표적 DNA 세그먼트의 복사본이 10억 개 이상 있을 수 있습니다.
PCR 적용 분야는 과학 연구, 의학, 법의학 및 기타 여러 분야에서 사용된다. 예를 들면 아래와 같다.
유전자 검사: 유전 질환 진단을 위해 환자 샘플에서 DNA를 증폭하거나 특정 유전 변이를 감지하는 데 사용한다.
법의학: 범죄 현장에서 수집한 DNA 증거를 분석하여 용의자 또는 피해자를 식별하는 데 사용한다.
생명 공학: 유전 공학 또는 복제 실험을 위해 대량의 DNA를 생산하는 데 사용한다.
고생물학: 고대 화석에서 DNA를 추출하고 증폭하여 종의 진화 역사에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용한다.
“발현 정도가 아닌 DNA 서열 분석을 위해 프라이머를 사용한다고 해요.
다음으로 염기서열 분석 시퀀싱 (Sequencing)이 있다고 말했다.
클로닝 (cloning), 단일 염기 다형성 (SNP) 분석, 메틸화 특이적 PCR (MS-PCR) 후 클로닝으로 DNA의 메틸화 정도를 분석하는 과정에도 사용될 수 있대요. 제가 해 보지는 못했지만 말이죠. 헤헤”
“그렇게나 많아?” 민이는 생전 처음 듣는 것처럼 놀라며 말했다.
“민 선배남도 다 안다고 안 하셨어요??”
“으응? 물론이지, 생각보다 내가 많이 알고 있어서 나도 놀랐네? 하하하”
멋적게 민이 웃는다.
“선배님이 사용할 템플릿template은 뭔가요?”
“으으응?”
민이는 초이 질문에 말꼬리를 살짝 올리며, 이마를 찡그리는데
(계속…)
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참조
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-pcr