이번 글에서는 프라이머 다이머가 왜 생기는지 Primer dimer 원인에 대해 살펴보겠다.
1. Primer dimer란?
프라이머 이량체, 프라이머 다이머 (primer dimer)는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 과정 중에 형성될 수 있는 비특이적 산물이다. 한 마디로 원하지 않는 산물인 것이다.
정방향 및 역방향 프라이머가 표적 DNA 주형에 결합하는 대신 서로 어닐링하여 프라이머-프라이머 복합체의 확장 및 증폭이 발생할 때 발생한다.
Primer dimer는 PCR 반응에 필요한 구성 성분을 소비하고 원하는 PCR 산물의 수율을 감소시키며 잠재적으로 이후의 분석을 방해할 수 있기에 지양하는 것이 좋다.
다행스럽게도 PCR에서 프라이머 이량체 형성을 방지하거나 최소화하기 위한 몇 가지 전략이 알려져 있다.
2. Primer dimer, 왜 생길까?
첫째, 프라이머가 상보적 서열일 때 Primer dimer가 생긴다:
프라이머 다이머는 정방향 및 역방향 프라이머가 3′ 말단에 상보적인 서열을 포함할 때 종종 형성된다. 이러한 상보적 서열은 서로 결합하여 프라이머 이합체를 형성할 수 있다.
둘째, 프라이머 내의 2차 구조가 있을 때:
프라이머 서열의 헤어핀 또는 자기 상보성과 같은 이차 구조는 프라이머-프라이머 상호 작용 및 후속 이량체 형성을 촉진할 수 있다.
마지막으로 프라이머가 고농도일 때:
고농도의 프라이머를 사용하면 프라이머-프라이머 상호 작용의 가능성이 높아져 이량체 형성 가능성이 높아진다.
3. 어떻게 해야 primer dimer 형성을 방지하거나 최소화 할까?
3-1. 고려해야 할 프라이머 디자인 조건들
a. 상보적 서열 제거 또는 최소화: 순방향 및 역방향 프라이머가 프라이머 어닐링에 중요한 3′ 말단에 중요한 상보적 서열을 갖지 않도록 한다. 소프트웨어 도구를 사용하여 프라이머 서열을 분석하여 잠재적인 상보성을 식별하고 방지한다.
b. 최적의 프라이머 길이 찾기: 권장 범위(18-30개 뉴클레오티드) 내에서 프라이머 길이를 조정하여 자가 어닐링 또는 프라이머-프라이머 상호 작용 가능성을 최소화한다.
c. 최적의 GC 함량 맞추기: 우선적 어닐링을 방지하기 위해 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이에 유사한 GC 함량을 유지한다. 약 40-60%의 GC 함량을 목표로 한다.
d. 2차 구조 확인하기: 소프트웨어 도구를 사용하여 프라이머 내 헤어핀 루프, 자체 상보성 및 기타 잠재적 2차 구조를 확인한다. 이러한 구조를 최소화하거나 제거하기 위해 프라이머 서열을 조정한다.
3-2. 프라이머의 농도 변화시켜 보기
PCR 반응에서 프라이머 농도를 최적화해 본다. 프라이머 농도를 줄이면 비특이적 상호작용과 이량체 형성을 최소화할 수 있다. 특정 프라이머 쌍에 대한 최적의 농도를 찾으려면 몇 가지 실험이 필요하다.
3-3. 프라이머 합성 시 수정해 볼 사항들
a. HPLC 정제: 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제를 제공하는 프라이머 합성 서비스를 선택하자. HPLC 정제는 더 짧고 잘못 합성된 올리고뉴클레오티드를 제거하여 프라이머 이합체 형성 가능성을 줄일 수 있다.
b. 프라이머 수정: 5′-포스포로티오에이트 결합 또는 잠금 핵산(LNA) 도입과 같은 일부 수정은 프라이머 특이성을 향상시키고 이합체 형성을 감소시킬 수 있다. 그러나 수정은 프라이머 합성 비용을 증가시킬 수 있다.
3-4. 최적의 PCR 조건 찾기
a. 어닐링 온도 최적화: PCR 중 어닐링 온도를 조정하여 비특이적 상호작용을 최소화하면서 프라이머가 표적 DNA 템플릿에 특이적 결합하도록 한다. gradient PCR을 사용하거나 온도 최적화 실험을 수행하여 최적의 어닐링 온도를 찾아야 한다.
b. Mg2+ 농도 최적화: PCR 반응에서 Mg2+ 농도를 최적화 해 본다. Mg2+는 프라이머-템플릿 혼성화에서 중요한 역할을 하며 농도를 변경하면 프라이머 특이성과 이량체 형성에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. Mg2+ 적정 실험을 수행하여 최적의 농도를 찾아 보자.
3-5. 겔 전기영동으로 분석해 보기
PCR을 수행한 후 증폭된 산물을 agarose gel 전기영동으로 분석해 본다. Primer 이량체는 일반적으로 원하는 PCR 제품 아래에 더 작은 밴드로 나타나는 특징적인 크기로 구별할 수 있다. PCR 산물을 전기영동하여 시각적으로 확인하여 프라이머 이량체의 존재를 확인하고 이를 최소화하기 위한 여러 전략이 적절한지 평가할 수 있다.
PCR products를 확인 할 때의 agarose gel 농도는 어떻게 할까?
이는 PCR products에 따라 결정하면 될 것이다.
예를 들어, 일반적인 PCR의 경우 대개 500bp 정도인데 나의 경우 1% 농도로 확인하며,
real-time PCR의 경우 products 사이즈가 200-300bp 정도로 1.5% 농도로,
primer dimer의 경우는 그 size가 50-100bp 사이이므로 2% 농도로 확인하고 있다.
참고로 주로 사용하는 Takara 사의 DNA ladder, 바이오니아 제품 등이 있다.
예를 들어 Takara Bio는 단편 크기가 20 bp ~ 2.5 kb인 DNA ladder 및 DNA 분자량 마커로 agarose 겔 전기영동 동안 핵산 크기 및 양 결정과 같은 다양한 응용 분야의 크기를 확인하는 데 사용된다.
요약하면, PCR에서 프라이머 이량체 형성을 방지하거나 최소화하기 위해서는 프라이머를 신중하게 설계하고 PCR 시 프라이머의 농도를 최적화하며, 수정 또는 정제 방법을 고려하는 것이다.
또한 어닐링 온도 및 Mg2+ 농도와 같은 PCR 조건을 최적화하면 프라이머 이량체 형성을 크게 줄일 수 있을 것이다. 또한 매 최적화 과정마다 겔 전기영동 분석을 통해 각 전략이 적절한지 여부를 평가하는 데 도움이 될 것이다.
이와 같은 몇 가지 전략을 통해 우리가 원하지 않는 프라이머 이량체를 줄이면서 PCR 증폭의 특이성과 효율성을 향상시킬 수 있기를 기대해 본다.
