Real-time PCR Ct 값으로 fold change 구하기 3단계

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지난 글에서 real-time PCR에서 자주 만나는 상위 문제 10가지와 해결법에 대해 생각해 보았다.

Real-time PCR에서 상위 10가지 문제와 해결법

그리고, SYBR 기반 시약 회사를 알아 보았다.

이번 글에서는 real-time PCR Ct 값으로 fold change 구하는 법을 알아 보고자 한다.

이 방법은 논문에서 자주 사용되는 Control군 대비 Test군의 target gene 발현을 상대적으로 비교하는 방법이다.

1. real-time PCR Ct 값으로 fold change 구하는 3단계

DNA helix and real-time PCR
DNA helix and real-time PCR

아래와 같이 크게 3단계로 계산한다.

  1. Target gene Ct mean – Endogenous gene Ct mean = △Ct mean
  2. Test △Ct mean – Control △Ct mean = △△Ct mean
  3. 2^-(△△Ct mean) = Fold change

Control 군과 Test 군의 각각의 Ct mean 수치에서 위 계산을 하여 2^-(△△Ct mean)을 산출하면 fold change를 얻을 수 있다.

2. Fold change 값 해석하기

위에서 계산한 2^-(△△Ct mean) Fold change 값을 얻었다면, 이번에는 이 값을 해석해 보자.

  1. 2^-(△△Ct mean) = 1.0, 즉 fold change가 1이라면, Test군과 Control군의 target gene의 발현이 동일하다는 의미이다.
  2. 2^-(△△Ct mean) > 1.0, 즉 fold change가 1보다 크다면, Test군의 target gene의 발현이 Control군보다 xx배 높다고 해석하고,
  3. 2^-(△△Ct mean) < 1.0, 즉 fold change가 1보다 작다면, Test군의 target gene의 발현이 Control군보다 낮다고 해석하면 될 것이다.

3. 예시: Real-time PCR Ct 값으로 fold change 구하기

real-time PCR은 전통적인 일반 PCR보다 민감한 기법이다. 따라서 시료 상태, 연구자의 파이펫팅 등에 따라 Ct 값의 변동이 심하다. 이를 최소화 하는 게 신뢰하고 일관적인 결과를 얻게 된다.

일반적으로 한 번 real-time PCR 수행할 경우 하나의 군 당 최소 3개 반복 (triplicate) PCR 반응을 수행하고 여기에서 얻은 3개의 Ct 값의 평균값을 사용한다 (여러번 수행하면 좋겠지만, 반응 비용과 시료 등을 고려해야 할 것이다)

당신은 “A”라는 약물이 A549라는 폐암 세포주에 TP53이라는 유전자의 mRNA 발현에 영향을 주는지 real-time PCR을 무사히 수행하여 아래와 같이 Ct 값을 얻었다고 가정해 보자.

<Control: DMSO-treated A549 Cells>

GAPDH: 19.20, 19.32, 19.41, 　

TP53: 15.31, 15.21, 15.15

<Test: Drug A-treated A549 Cells>

GAPDH 19.31 19.23 19.33 　

TP53 12.51, 12.31, 12.11

위에 기술한 3단계 계산법을 생각해 보자

  1. Target gene (TP53) Ct mean – Endogenous gene (GAPDH) Ct mean = △Ct mean
  2. Test △Ct mean – Control △Ct mean = △△Ct mean
  3. 2^-(△△Ct mean) = Fold change

자, 어떤가? A라는 약물은 TP53의 mRNA 발현을 증가시켰는가? 감소시켰는가?

계산을 Excel에서 해 보면, 아래와 같다.

real-time PCR Ct calculation Excel 수식
real-time PCR Ct calculation Excel 수식

Excel 결과는 아래와 같다

real-time PCR Ct calculation Excel 결과
real-time PCR Ct calculation Excel 결과

위 결과를 보면, 2^-(△△Ct mean) = 7.43 이다. 즉, 약물 A를 처리한 A549 폐암 세포주는 DMSO를 처리한 대조군에서보다 TP53의 mRNA 발현을 7.43배 증가시킨다는 것으로 해석할 수 있겠다.

delta delta Ct 값과 Fold change 자동 계산 링크
delta delta Ct 값과 Fold change 자동 계산 링크

4. 관련 문헌 맛보기

참고할 만한 논문 자료 링크는 아래와 같다.

“이노시톨 헥사포스페이트를 처리한 인간 대장암 HT-29 세포에서 p53 및 p21(WAF1) mRNA 수준의 정량 분석” (Quantitative analysis of the level of p53 and p21(WAF1) mRNA in human colon cancer HT-29 cells treated with inositol hexaphosphate)

이 연구의 목적은 대장암 세포의 증식과 세포 주기 진행을 억제할 수 있는 이노시톨 헥사포스페이트(InsP(6)) 작용의 분자 메커니즘을 분석하는 것이다. 6, 12, 24 및 48시간 동안 1, 5 및 10mM 농도별로 InsP(6)로 처리한 후 인간 대장암 HT-29 세포에서 p53 및 p21(WAF1) mRNA 증가의 변화 연구를 수행하였다.

이러한 유전자의 전사 수준을 정량적으로 분석하기 위해 TaqMan 방법론에 기반한 실시간 QPCR을 적용다하였다. 베타-액틴 및 GAPDH 유전자의 전사를 나란히 평가하여 변동성이 가장 적은 대조군 유전자를 선택했다. 2(-Delta Delta Ct) 방법은 유전자 전사의 상대적인 변화를 분석하는 데 사용되었다.

InsP(6)는 p53 및 p21(WAF1) 발현을 mRNA 수준에서 촉진시켰으며, p21(WAF1) mRNA의 가장 높은 증가는 24시간, 즉 12시간에서 관찰된 p53 mRNA의 가장 높은 증가에 따라 발생했다.

이번 연구를 바탕으로 세포 주기를 정지시키는 InsP(6)의 능력은 p53에 반응하는 p21(WAF1) 유전자의 전사적 증가에 의해 중재되는 것이라 결론을 내릴 수 있다.

(전문 링크: http://www.actabp.pl/pdf/2_2006/349.pdf)

이 논문에서 참고할 만한 것은 베타-액틴과 GAPDH를 Endogenous gene으로 (흔히 말하는 internal control, housekeeping gene) 함께 평가하여 변동성이 적은 유전자를 선별하여 사용했다는 점이다.

우리가 믿는 housekeeping gene은 외부 자극에 늘 일정하지 않기 때문에, 각 연구 성격에 따라 테스트하여 적절한 internal gene을 선별해서 사용해야 한다는 것을 기억해야 한다.

왜냐하면, 오늘 다룬 Ct 상대적 계산법에서 이들 internal 유전자가 흔들린다면 결과 값이 변하기 때문이다!

꼭 기억하기 바란다!

끝까지 읽어 주셔서 감사합니다.

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