먼저 Western Blotting에 대해 간략히 살펴보자.
Western Blotting이란?
웨스턴 블롯팅 Western Blotting은 면역블롯팅 immunoblotting으로도 알려진 단백질 검출 및 분석을 위해 널리 사용되는 실험 기법이다. 이를 통해 세포 lysis 또는 조직 추출물과 같은 샘플에서 특정 단백질을 식별하고 정량화할 수 있다. 이 기술은 겔 전기영동에 의한 단백질 분리, 고체 막으로의 단백질 전달 및 특정 항체 기반 검출 과정을 포함한다.
Western blotting 과정에는 여러 단계가 포함됩니다. 먼저 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)라는 기술을 사용하여 크기에 따라 단백질을 분리한다. 다음으로 단백질은 젤에서 일반적으로 니트로셀룰로오스 nitrocelluose 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF)로 만들어진 멤브레인 membrane으로 전달된다. 이 전달 단계를 통해 막의 상대적인 위치에 단백질을 옮길 수 있다.
다음으로 멤브레인은 우리가 관심을 가지는 표적 단백질에 결합하는 특정 1차 항체와 함께 incubation 과정을 거친다. 여기에서 사용하는 1차 항체는 고유한 에피토프epitope를 기반으로 표적 단백질을 인식하고 결합할 수 있다. 그 후 멤브레인을 washing 단계를 통해 결합되지 않은 항체를 제거한다.
관심을 가지는 단백질을 시각화하기 위해 2 항체를 멤브레인과 incubation 한다. 2차 항체는 일반적으로 효소 또는 형광 태그에 결합되어 있다. 2차 항체는 1차 항체에 특이적으로 결합하고 부착된 효소 또는 형광단은 기질을 추가하거나 적절한 이미징 조건에서 감지 가능한 신호를 생산한다.
이미징 결과 신호는 화학 발광 또는 형광 검출과 같은 다양한 방법을 사용하여 시각화되고 관련 소프트웨어를 통해 정량화가 가능하다. 여기에서 나타나는 신호의 강도는 샘플에 존재하는 표적 단백질의 양에 해당한다.
Western blotting은 분자 생물학, 생화학 및 생물 의학을 포함한 많은 생물학 연구 분야에서 사용되는 다재다능한 실험 기법이다. 특정 단백질을 확인하고, 정량화가 가능하여 다양한 세포 과정 및 질병 기전을 분석하기 위한 고전적이기는 해도 오랜 세월 동안 사용되는 기법이라고 할 수 있다.
다음으로, Western Blotting에서 대표적인 10가지 문제와 해결책을 공유해 보고자 한다.
Western Blotting에서 대표적인 10가지 문제와 해결책
- 밴드 뒤의 background가 높아요
Western Blotting에서 blocking 조건을 최적화하고, 항체 농도를 낮추고, 보다 특이적인 2차 항체를 사용한다. 또한 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 적절한 washing 단계를 확인하고 조정해 보자.
2. 비특이적 밴드 (잡다한 밴드)가 많아요
비특이적 결합을 제거하기 위해 washing단계를 좀 더 강도를 높여보거나 washing 수를 증가시켜보자. 무지방 분유 또는 소 혈청 알부민(BSA)를 사용하여 blocking 버퍼를 제조하여 사용한다. blocking peptide를 사용해 본다.
3. 밴드가 희미하거나 아예 없어요
단백질 추출 및 샘플 준비 단계를 최적화한다 (샘플 농도를 증가시켜 본다). 사용하는 1차 항체의 질과 농도를 확인하여 조정해 본다(1차 항체 농도를 증가시켜 본다). 향상된 화학발광(ECL) 또는 형광과 같은 신호 증폭 기술을 사용해 보자.
4. 밴드가 번져요
SDS-PAGE 단계를 최적화하여 더 나은 분해능을 사용한다. 단백질 샘플의 질을 확인하고 저하되지 않았는지 확인한다. 단백질이 분해 되지 않았는지 확인한다. 단백질을 멤브레인으로 효율적으로 전달할 수 있도록 전달 조건을 최적화한다.
5. Loading control로 사용하는 밴드가 일정하지 않아요
loading한 단백질 샘플의 양이 동일한지 확인한다. actin이나 GAPDH와 같은 House keeping 단백질과 같은 적절한 로딩 컨트롤을 사용하여 밴드 강도가 동일한지 확인하자. 또한 일관된 단백질 전달을 위해 전달 조건을 최적화하는 것이 좋다.
6. 밴드가 뭉쳤어요
단백질 추출 및 샘플 준비를 최적화하는 것이 필요하다. 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플 버퍼에 적절한 농도와 종류의 프로테아제 억제제를 사용하자. 적절한 detergent를 사용하고 농도를 최적화하여 단백질 응집을 확인하여 최적의 조건을 찾자.
7. 반복실험 했을 때 결과가 일치하지 않아요
샘플 취급과 보관에 주의하자. 실험 시 incubation 시간, 온도 및 시약 농도를 포함한 실험 조건을 최적화하는 것이 좋다. Western blotting 과정 전반에 걸쳐 일관성 있게 사용하는 시약, 버퍼 등의 관리를 잘 하자.
8. 단백질이 membrane에 잘 transfer 된 것 같지 않아요
적절한 분자량 마커를 사용하여 전달 효율을 확인하자. transfer시 시간, 전압 및 버퍼 구성과 같은 전달 조건을 최적화하자. membrane이 충분히 버퍼에 담궈 놓았는지 SDS-PAGE 겔과 membrane 사이가 잘 접촉하고 있는지 확인한다.
9. 원하는 분자량이 안 나와요
알려진 크기의 분자량 마커 standard marker를 포함하여 표적 단백질의 크기를 확인하자. 겔 농도 및 단백질 분리 조건을 최적화하여 SDS-PAGE 분리능을 개선해 보자.
10. 이전 결과와 다르게 나와요
표준화된 프로토콜을 따르고 모든 단계를 기록하자. 사용한 시약 준비와 보관을 잘 하자. 실험을 반복하고 적절한 통계 분석을 사용하여 결과를 검증할 필요가 있다. Western blotting의 경험을 가진 동료와 지도 교수님의 지침을 구하고 문제 해결 팁에 대한 문헌을 찾아보자.
Western blotting은 샘플 준비부터 SDS-PAGE 전기영동, transfer, 항체 부착과 washing, ECL 반응과 시각화 등의 복잡한 단계를 거쳐야 하기 때문에 매 단계마다 주의 사항 및 최적화 과정이 중요함을 기억하자.
따라서 각 단계마다 위에서 설명한 문제를 포함하여 변수를 조정하고 피드백하며 확인하는 것이 필요하다.