이번 글은 Primer design 문제점과 솔루션 베스트 10가지를 공유해 보고자 한다.
Primer 문제점과 솔루션 베스트 10가지
1. 비특이적 증폭 Non-specific amplification
Primer design 문제점에서 비특이적 증폭은 Primer3 또는 NCBI-BLAST에서 제공하는 온라인 primer design 소프트웨어를 사용하여 잠재적인 비표적 결합에 대한 프라이머 서열을 확인하여 이들은 배제하는 것이 좋다. 프라이머 길이, GC 함량을 조정하고 템플릿에서 반복적이거나 복잡성이 낮은 영역은 피함으로써 프라이머의 특이성을 최적화하는 것이 중요하다.
2. 프라이머-다이머(dimer) 형성
순방향 Forward 프라이머와 역방향 Reverse 프라이머 사이의 상보성을 최소화하기 위해 프라이머 서열을 조정하는 것이 필요하고, 이 두 종류의 프라이머 사이에 서열 유사성이 있다면 그런 영역은 피하자.
3. 프라이머 길이 primer length
일반적으로 권장하는 프라이머의 길이 범위(PCR의 경우 18-25개 뉴클레오티드) 내에서 프라이머 길이를 최적화하는 것이 좋다. PCR 특이성과 어닐링 annealing 효율을 개선하기 위해 필요에 따라 프라이머를 줄이거나 늘린다.
4. 교차 반응성
잠재적인 교차 반응성에 대한 프라이머 서열을 분석한다. 표적 외 증폭 흔히 말하는 비특이적 반응을 최소화하기 위해 게놈의 의도하지 않은 영역과 유사한 프라이머는 피하는 것이 좋다. 나의 경우 예비 Primer 서열을 BLAST로 검색하여 이를 확인한다.
5. 용융 온도(Tm) 불일치
Primer3 (현재는 Primer3plus: https://www.primer3plus.com/)난 BLAST-Primer (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?GROUP_TARGET=on)과 같은 온라인 도구 또는 프라이머 디자인 소프트웨어를 사용하여 프라이머의 Tm을 계산한다. 효율적인 프라이머 어닐링을 촉진하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머의 Tm 값이 일반적으로 2-4°C 내에서 유사한 것이 좋다.
6. GC 함량 (GC content)
최적 범위인 40-60% 내에서 프라이머의 GC 함량을 확인하여 선별한다. 프라이머 서열을 수정하여 GC 함량의 균형을 맞추고 극단적인 값을 최소화하여 프라이머 특이성과 어닐링을 개선하는 것이 좋다. 이것은 상기한 5번 프라이머 Tm과도 밀접하다.
7. 헤어핀 hairpin 형성
잠재적인 헤어핀 구조에 대한 프라이머 서열을 분석한다. 프라이머 서열을 조정하여 헤어핀 형성을 제거하거나 최소화하여 효율적인 프라이머-템플릿 결합이 이루어지도록 하는 것이 좋다.
8. 반복 영역의 프라이머 디자인
반복 서열을 포함하는 프라이머를 디자인 할 경우 특수 프라이머 디자인 소프트웨어를 사용한다. 특정 증폭을 보장하기 위해 반복 서열에 대한 직접적인 결합을 피하면서 반복 영역의 측면에 프라이머를 설계한다.
9. 템플릿 보조 구조
템플릿 서열을 분석하여 잠재적인 이차 구조에 대한 헤어핀 형성 또는 기타 2차 구조가 발생하기 쉬운 영역을 피하는 프라이머를 디자인하는 것이 좋다.
10. 다중 PCR muliplex PCR을 위한 프라이머 디자인
다중 PCR용 프라이머를 설계할 수 있는 프라이머 설계 소프트웨어를 활용하자. 교차 반응성이 최소화된 프라이머를 선택하여 프라이머 호환성을 최적화하고 서로 다른 표적 서열 간의 프라이머 상호작용을 방지하자.
위에서 설명한 프라이머 디자인 시 부딪치는 문제를 해결하는 것은 반복적으로 이루어지는 일임을 상기하자. PCR 증폭이 잘 되도록 하기 위해 여러 가지 변수를 피드백으로 조정하여 프라이머 서열을 최적화 하는 것이 중요하고 이를 위해 소프트웨어나 관련 도구와 동료와의 피드백이 필요하다고 생각한다.
무엇보다 필요한 것은 디자인한 프라이머를 사용하여 직접 PCR을 함으로써 테스트 해 보고, 피드백하여 조정하는 것이다.
나의 경우에는 몇 가지 세트의 프라이머를 디자인 합성하여 PCR을 수행해 보고 가장 좋은 효율과 높은 특이성 등을 보이는 프라이머를 선별하는 편이다. 물론 여러 논문들에서 언급된 프라이머를 사용하는 것도 한 방법이나, 실제 이들을 사용할 경우에도 PCR 실험을 통해 확인해 볼 것을 권한다.
PCR primer design 관련 Addgene에서 제공하는 링크다.
Real-time PCR Ct 값으로 fold change 구하기 3단계
Real-time PCR SYBR 기반 시약 관련 3사
Primer-BLAST는 Primer3와 BLAST를 사용하여 PCR 템플릿에 특정한 프라이머를 찾는 찾을 수 있는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 프라이머 설계 도구 중 무료로 사용할 수 있다. 목적으로 하는 PCR의 템플릿, 전방향 프라이머, 역방향 프라이머, PCR products 크기, 프라이머 Tm 온도 등의 매개 변수를 입력하여 특정한 프라이머를 찾을 수 있다.