이번 글에서는 Real-time PCR에서 상위 10가지 문제와 해결법에 대해 생각해 보고자 한다.
Real-time PCR이란?
핵산 분자 실시간 증폭과 정량화, Real-time PCR
정량적 PCR (qPCR)이라고도 하는 실시간 PCR (Real-time PCR, 중합효소 연쇄 반응)은 DNA 또는 RNA 분자를 실시간으로 증폭하고 정량화하는 데 사용되는 강력한 분자 생물학 기술이다. 이를 통해 우리는 증폭 과정이 일어나는 대로 실시간 모니터링할 수 있으므로 대상 분자의 초기 양을 정확하게 측정할 수 있다. 실시간 PCR은 유전자 발현 분석 뿐만 아니라 병원체 검출, 유전자 프로파일링 등 다양한 응용 분야에서 널리 사용되고 있다.
Real-Time PCR의 원리는 증폭된 DNA 또는 RNA의 양에 비례하여 신호를 방출하는 형광 리포터 분자를 사용하는 것이다. SYBR Green과 같은 DNA 삽입 염료 또는 서열별 프로브(예: TaqMan probe)와 같은 다양한 유형의 형광 리포터가 있다. PCR 반응은 각 증폭 반응 주기 동안 방출되는 형광을 측정하기 위해 특수 광학 검출 시스템이 장착된 열 순환 장치에서 수행된다.
Real-time PCR 상위 10가지 문제와 해결책
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다음은 Real-Time PCR 중에 직면할 수 있는 상위 10가지 문제와 생각해 볼 수 있는 해결책이다.
1.프라이머 설계 문제
앞서 설명한 Primer design 글에서처럼 적절한 프라이머 디자인 소프트웨어를 사용하여 프라이머가 표적 서열에 특이적이고 균형 잡힌 녹는점을 가지며 최소한의 2차 구조를 갖도록 하여 프라이머를 설계한다.
2. 비특이적 증폭
프라이머 농도와 어닐링 온도를 최적화한다. 증폭물의 특이성을 확인하기 위해 용융 곡선 분석을 수행한다다.
3. 비효율적인 증폭
프라이머 농도, 어닐링 온도 및 확장 시간을 포함한 PCR 조건을 최적화한다. 템플릿 DNA 또는 RNA의 무결성과 품질을 확인한다.
4. 높은 background와 noise
반응 성분 및 농도를 최적화한다. 정제된 템플릿 DNA 또는 RNA를 사용하자. 종종 발생하는 오염을 방지하기 위해 시약을 적절하게 취급하고 보관하는 것이 좋다.
5. 일관되지 않거나 재현 불가능한 결과
프로토콜을 표준화하고 반응 조건을 최적화한다. 반복 반응을 수행하고 양성 및 음성 대조군을 포함하여 반응시킨다. 파이펫팅의 정확성과 템플릿의 품질을 확인하는 것이 좋다.
6. PCR 억제
템플릿 DNA 또는 RNA 추출을 최적화하여 잠재적인 억제제를 제거한다. 고농축 샘플을 희석한다. 억제 물질을 극복하기 위해 특수 PCR 첨가제를 사용하자.
7. PCR 효율성 변화
표적 분자의 농도를 알고 있는 표준 곡선을 사용하여 PCR 분석의 효율성을 검증한다. 프라이머 효율성을 보장하고 반응 조건을 최적화한다.
8. 낮은 감도
프라이머 농도, 어닐링 온도 및 확장 시간을 최적화한다. 보다 민감한 검출 화학을 사용하거나 사전 증폭 기술을 고려해 보자.
9. 오염 문제
오염을 방지하기 위해 엄격한 실험 프로토콜을 따른다. PCR 각 단계마다의 여러 단계에 대해 별도의 작업 공간을 사용하는 것이 좋다. 오염을 모니터링하기 위해 적절한 음성 컨트롤을 포함시켜 진행한다.
10. 데이터 분석
적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 역치 주기(Ct 값)를 결정하고 상대적 발현 수준을 계산한다. 결과를 정확하게 비교하고 해석하기 위해 통계적 방법을 적용한다.
Real-Time PCR 문제를 해결할 때 잠재적인 문제를 체계적으로 확인하고 해결하는 것이 중요하다. PCR 반응 조건, 분석 설계 및 품질 관리를 최적화 하는 것은 실시간 PCR 결과의 신뢰성과 정확성을 크게 향상시킬 수 있으리라 본다. 또한 관련 문헌을 참조하고 숙련된 전문가 혹은 경험자의 조언을 구하고 관련 교육 과정에 참석하면 Real-Time PCR 실험에서 특정 문제를 해결하기 위한 귀중한 통찰력과 지침을 얻을 수 있으리라 생각한다.
Primer-BLAST는 Primer3와 BLAST를 사용하여 PCR 템플릿에 특정한 프라이머를 찾는 찾을 수 있는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 프라이머 설계 도구 중 무료로 사용할 수 있다. 목적으로 하는 PCR의 템플릿, 전방향 프라이머, 역방향 프라이머, PCR products 크기, 프라이머 Tm 온도 등의 매개 변수를 입력하여 특정한 프라이머를 찾을 수 있다.
끝까지 읽어 주셔서 감사 드린다.