이번 글에서는 Real-time PCR SYBR 시약3사를 알아보고자 한다.
1. 어떤 키트를 선택할까요: 시료, 표적 유전자, 검출 화학 유형에 따라
실험에 적합한 qPCR 키트를 선택하는 것은 시료 유형, 표적 유전자 및 검출 방법을 포함한 여러 요인에 따라 달라진다. 실험에 적합한 qPCR 키트를 선택하는 데 도움이 되는 몇 가지 내용을 공유해 본다.
시료 유형은 무엇인가:
샘플 유형에 따라 real-time PCR 분석을 위한 고품질의 RNA 또는 DNA를 얻기 위해 다른 추출 및 정제 방법을 사용한다. 사용하는 특정 시료 유형에 맞는 키트를 선택한다.
표적 유전자는 무엇인가:
RNA를 분석하는 경우 RNA를 cDNA로 변환하기 위한 역전사 시약이 포함된 키트를 사용할 수 있다 (물론 RNA를 cDNA로 별도의 과정으로 합성한 후 사용할 수도 있지만). DNA를 분석하는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있다.
어떤 검출 화학 유형을 사용할 것인가:
qPCR에 사용되는 검출 화학 유형에는 DNA 결합 염료와 probe 기반 화학의 두 가지 주요 유형이 있다. SYBR Green과 같은 DNA 결합 염료는 이중 가닥 DNA에 결합하고 광원에 의해 활성화 될 때 형광을 방출한다. 반면 TaqMan probe와 같은 probe 기반 화학은 특정 표적 서열에 hybridization하고 증폭 중에 중합효소에 의해 절단될 때 형광을 방출하는 형광 표지 probe를 사용하는 방식이다.
장비 호환성은 어떤가:
선택한 키트가 real-time PCR 장비와 호환되는지 확인하는 것도 중요하다. 대개는 호환되지만 말이다.
성능은 일관되고 신뢰할 만한가:
신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 검증되고 입증된 키트를 선택하자. 실험마다 다른 결과 값을 도출하는 키트라면? NO!
개인적으로 제안하자면, 어떤 real-time PCR키트를 사용할지는 각 회사에 샘플 키트를 요청하여 (대개는 샘플을 제공한다) 사전에 테스트 과정을 통해 비교해 보는 것이다.
2. SYBR과 TaqMan probe의 차이는 뭔가요: 검출 화학
SYBR Green 및 TaqMan probe는 real-time PCR에 사용되는 두 가지 유형의 검출 화학이라고 할 수 있다.
SYBR Green은 이중 가닥 DNA에 결합하는 형광 염료다. Real-time PCR 동안 증폭된 DNA의 양이 증가함에 따라 SYBR Green의 형광 신호도 증가한다. SYBR Green은 real-time PCR을 위한 비교적 저렴하고 사용하기 쉬운 옵션이지만 primer-dimer와 같은 비특이적 증폭 제품에서 그릇된 신호를 생성할 수 있으며, 이로 인해 결과 값이 곡해될 수 있다.
따라서, 이를 막기 위해 특히 중요한 것이 바로 Primer design이다.
반면에 TaqMan probe는 한쪽 끝에는 형광 리포터 염료로, 다른 쪽 끝에는 소광제 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드 probe다. probe는 증폭된 DNA 내의 특정 표적 서열에 hybridization 하도록 설계된다. 증폭하는 동안 probe는 Taq 중합효소의 5’에서 3′ 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 활성에 의해 절단되어 reporter 염료를 quencher 염료에서 분리하고 형광 신호를 생성하게 된다. TaqMan probe는 매우 특이적이고 민감하지만 SYBR Green에 비해 설계 및 최적화에 더 많은 비용과 시간이 소요될 수 있다.
요약하면 SYBR Green 염료와 TaqMan probe의 주요 차이점은 형광 신호를 어떻게 생성하느냐는 메커니즘의 차이라고 하겠다. SYBR Green은 모든 이중 가닥 DNA에 결합하는 반면 TaqMan probe는 특정 표적 서열에 hybridization한다. 각 방법에는 장점과 단점이 있으며 그 중에서 선택하는 것은 실험의 특정 요구 사항에 따라 다르다.
비용과 시간을 고려할 때 SYBR Green 염료를 기반으로 하는 real-time PCR을 대개 많이 사용하는 편이다.
3. Real-time PCR SYBR 기반 PCR 키트 3사
Real-time PCR SYBR 기반 PCR 키트 회사는
SYBR Green 검출 화학을 사용하는 키트는 많이 있다. 대표적으로 QIAGEN의 QuantiTect SYBR Green PCR Kit, Bio-Rad 사의 SYBR Green qPCR Supermixes, Thermo Fisher Scientific 사의 DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit 가 있다.
이들 키트는 SYBR Green I 검출을 사용하여 매우 특이적이고 민감한 핵산 정량을 제공하도록 설계되었다고 하며, 대부분의 real-time PCR 장비와 호환되며 cDNA 표적의 유전자 발현 분석 및 정량적 gDNA 분석에 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다.
앞서 설명하였지만, 어떤 real-time PCR키트를 사용할지는 시료 등을 고려하되 각 회사에 샘플 키트를 요청하여 (대개는 샘플을 제공한다) 사전에 테스트 과정을 통해 비교해 보는 것이다.
4. 시료 양이 적어요: One-step real-time PCR 키트를 사용하자
예를 들어, RNA를 사용하여 real-time PCR을 하고자 한다 치자. 암 세포주와 같이 배양하기도 비교적 쉽고, 세포가 증식하는 시간 (doubling time이 24-36시간 정도)도 빠르다면 real-time PCR에 사용하는 시료 양을 확보하는 게 큰 문제가 아니겠지만, 사안에 따라 시료 양이 너무 적을 경우가 있을 것이다.
이럴 경우에는 개인적으로 One-step real-time PCR 키트를 사용해 보라고 제안하고 싶다.
일반적으로 크게 3단계 RNA-cDNA합성-real time PCR 의 과정으로 진행한다면,
- RNA-cDNA 합성
- real-time PCR 로 대개는 진행하지만
시료 양이 적다면 한 tube에서 1+2 반응을 진행하는 것이 바로 One-step real-time PCR 이다.
개인적으로 사용해보고 만족했던 제품은 해외 사 제품보다 비교적 저렴하고, 서비스도 괜찮았던 국내 사 바이오팩트 제품이다.
BioFACT™ OneStep qRT-PCR Master Mix (For Intercalating Dye)의 경우다.