이번 글에서는 16s rRNA v3-v4 primer에 대해 다루어 보고자 한다.

1. 마이크로바이옴이란?

마이크로바이옴 때로 미생물총 microbiome은 인체 피부, 장과 환경을 포함하여 우리 주변에 존재하는 작은 유기체 집합으로 다양한 생태계에서 중요한 역할을 하며 우리의 건강에 긍정적인 영향 뿐만 아니라 부정적인 영향도 미칠 수 있다. 이러한 미생물을 연구하고 그 다양성을 이해하는 것은 과학자들에게 중요한 주제가 될 수 있다. 미생물의 기능과 세상 뿐 만 아니라 인체 건강에 미치는 영향을 탐구할 수 있기 때문이다.

그렇다면 마이크로바옴을 어떻게 연구할 수 있을까?

이들을 조사하는 여러 방법 중 한 가지가 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA)라고 하는 세포에서 발견되는 특정 유형의 유전 물질을 분석하는 것이다. 특히 16S 리보솜 RNA 유전자라고 불리는 16S rRNA의 특정 영역에 초점을 둔다. 왜냐하면, 이 유전자에는 두 가지 주요 미생물 그룹인 다양한 유형의 박테리아와 고세균을 식별하고 분류하는 데 도움이 되는 귀중한 정보가 포함되어 있기 때문이다.

16S 리보솜 RNA 유전자를 연구하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)이라는 기술을 사용한다. PCR으로 DNA의 특정 부분, 이 경우 16S rRNA 유전자의 많은 복사본을 만들 수 있기 때문이다.

2. 왜 하필 16s rRNA v3-v4 primer인가?

16S rRNA 유전자는 박테리아와 고세균의 서로 다른 종에 걸쳐 상대적으로 보존된(유사한) 특정 영역과 종 간에 더 가변적인(차이가 있는) 영역을 가지고 있다. 이러한 가변 영역은 다양한 유형의 미생물을 식별하는 데 사용할 수 있는 일종의 인간의 지문처럼 미생물 고유의 서명과 같은 역할을 한다. 일반적으로 이러한 가변 영역 중 하나가 바로 V3-V4 영역이다.

V3-V4 영역은 16S rRNA 유전자의 특정 부분으로, 서로 다른 미생물 종을 구별하는 데 매우 유용한 것으로 알려져 있다. 여기에는 샘플에 존재하는 미생물의 유형과 이들의 상대적 존재비를 결정할 수 있는 주요 유전자 서열이 포함되어 있다. 이 특정 영역을 대상으로 전체 16S rRNA 유전자 서열을 연구하지 않고도 미생물 군집에 대한 귀중한 정보를 수집할 수 있는 것이다.

V3-V4 영역을 대상으로 하는 16S rRNA PCR을 수행하기 위해 먼저 미생물을 포함하는 샘플을 수집한다. 이것은 미생물이 포함된 표면을 면봉으로 닦거나, 대변 샘플을 수집하거나, 미생물이 발견되는 모든 환경에서 샘플을 얻을 수 있다. 다음으로 수집된 샘플에서 DNA를 추출하고 16S rRNA 유전자의 보존 영역과 일치하도록 설계된 특정 프라이머(짧은 DNA 서열)를 DNA에 추가한다.

이 프라이머는 PCR 반응의 “시작점” 역할을 하여 DNA가 복사될 수 있도록 한 다음 DNA 혼합물은 DNA가 증폭될 수 있도록 일련의 일종의 가열 및 냉각 단계를 거쳐 16S rRNA 유전자의 많은 복제본을 생성한다. 이 증폭된 DNA는 존재하는 미생물의 유형을 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다.

PCR 증폭 후 DNA 시퀀싱이라는 기술을 사용하여 16S rRNA 유전자의 유전 정보를 분석한다. DNA 시퀀싱을 통해 전자를 구성하는 빌딩 블록 또는 뉴클레오티드의 순서를 결정할 수 있다. V3-V4 영역에서 얻은 서열을 알려진 미생물 서열의 방대한 데이터베이스와 비교함으로써 샘플에 존재하는 미생물의 유형을 식별하고 그들의 다양성과 풍부도를 분석할 수 있다.

종합적으로, V3-V4 영역을 대상으로 하는 16S rRNA PCR은 미생물 세계를 탐구하고 이해할 수 있게 해주는 강력한 도구라고 하겠다. 16S rRNA 유전자의 이 V3-V4특정 영역을 연구함으로써 샘플에서 다양한 유형의 박테리아와 고세균을 식별하고 분류할 수 있으며, 이 기술은 미생물 군집의 구성과 다양성에 대한 귀중한 정보를 제공하고, 최근에는 인체 질병과의 연관성에 대한 이해를 돕고 있다고 하겠다.

3. 참고 문헌

아래는 16s rRNA v3-v4 primer 관련 논문이다.

Benchmark of 16S rRNA gene amplicon sequencing using Japanese gut microbiome data from the V1–V2 and V3–V4 primer sets

초록

배경: 16S rRNA gene amplicon sequencing(16S analysis)은 차세대 염기서열 분석 기술로 미생물군을 분석하는 데 널리 사용된다. 여기에서 변형된 V1-V2(V12) 및 표준 V3-V4 프라이머(V34) 세트를 사용하여 장내 미생물 분석 프로토콜을 최적화하여 192명의 일본인 지원자의 배설물 16S 분석 데이터를 비교했다.

결과: QIIME1 및 QIIME2 분석 결과 V12 데이터보다 V34 데이터에서 분류되지 않은 대표 시퀀스의 수가 더 많았다. 박테리아 구성의 비교는 문phyla 수준에서 Actinobacteria와 Verrucomicrobia가 V12보다 V34에서 더 높은 수준으로 검출되었음을 보여주었다. 이 문phyla 중에서 우리는 V34로 Bifidobacterium과 Akkermansia의 상대적인 구성이 더 높은 것을 관찰했다. 실제 풍부도를 추정하기 위해 Akkermansia 및 Bifidobacterium에 대한 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 수행했다. 우리는 qPCR에 의해 검출된 Akkermansia의 풍부함이 V12 데이터에 가깝지만 V34 데이터보다 현저하게 낮다는 것을 발견했다. qPCR에 의해 검출된 Bifidobacterium의 풍부도는 V12 및 V34 데이터보다 높았다.

결론: 이러한 결과는 V34 영역에서 파생된 박테리아 구성이 특정 장내 박테리아의 실제 존재비와 다를 수 있음을 시사한다. 따라서 변형된 V12 프라이머 세트의 사용이 일본 장내 미생물의 16S 분석에서 더 바람직하다고 결론지었다.

키워드: 16S rRNA; 미생물총; 차세대 시퀀싱.

이 논문에서 사용된 16s rRNA v1-v2, 16s rRNA v3-v4 primer는 아래와 같다.

16s rRNA v1-v2 : the forward primer (16S_27Fmod: TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG AGR GTT TGA TYM TGG CTC AG) and the reverse primer (16S_338R: GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GTG CTG CCT CCC GTA GGA GT).

16s rRNA v3-v4 primer: the forward primer (16S_341F: TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG) and the reverse primer (16S_805R: GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C)