isoform을 가진 유전자의 프라이머 디자인 10단계

SYBR Green을 사용한 real-time PCR에서 primer의 길이는 일반적으로 18~24 base가 적합하다.

SYBR Green은 PCR 증폭물을 검출하는 데 사용되는 DNA 결합 염료로, 특정한 서열이 아닌 이중 가닥 DNA 사이에 끼어들어간다. 따라서, SYBR Green을 사용하는 real-time PCR에서는 primer의 특이성이 매우 중요하다.

SYBR Green을 사용한 real-time PCR의 최적화를 위해 필요한 조건

SYBR Green을 사용한 real-time PCR의 최적화를 위해 필요한 조건을 생각해 보자.

1. 프라이머의 GC 함량은 50~60% 사이가 좋다.
2. Primer의 Tm 값은 50~65°C 사이가 좋다.
3. Primer의 Tm 값은 서로 비슷해야 한다.
4. Primer의 3′-end에 G나 C가 연속해서 나타나지 않도록 해야 한다.
5. Primer 간에 상보적인 서열이 없도록 해야 한다.
6. Primer와 template 간에 상보적인 서열이 없도록 해야 한다.
7. 증폭물의 길이는 75~200 bp 사이가 좋다.
8. 증폭물의 GC 함량은 50~60% 사이가 좋다.
9. 증폭물에 이중 나선 구조가 없도록 해야 한다.
10. products에 단일 염기 반복 서열이 없도록 한다.

위와 같은 방안들을 활용하여 SYBR Green을 사용한 real-time PCR primer의 최적화를 할 수 있다.

isoform을 가진 유전자의 primer 디자인

SYBR Green을 사용하여 real-time PCR을 위해 여러 개의 isoforms RNA에서 특이적인 RNA primer를 디자인 하기 위해서는 다음을 고려하는 것이 바람직하다.

1. 각 isoform의 서열을 분석하여 isoform 간에 차이가 있는 영역을 찾는다.
2. 차이가 있는 영역에서 primer를 디자인한다.
3. Primer의 길이는 일반적으로 18~24 base가 적합하다.
4. Primer의 GC 함량은 50~60% 사이가 좋다.
5. Primer의 Tm 값은 50~65°C 사이가 좋다.
6. Primer의 Tm 값은 서로 비슷해야 한다.
7. Primer의 3′-end에 G나 C가 연속해서 나타나지 않도록 해야 한다.
8. Primer 간에 상보적인 서열이 없도록 해야 한다.
9. Primer와 template 간에 상보적인 서열이 없도록 해야 한다.
10. 일반적으로 real-time PCR product의 길이는 75~200 bp 사이가 좋다.

위와 같은 방안들을 활용하여 SYBR Green을 사용하여 real-time PCR을 위해 여러 개의 isoforms RNA에서 특이적인 RNA primer를 디자인 할 수 있다.