“응, R 어쩌구라고 K가 그러던데…?”
민은 평소 초이 앞에서 지도 교수를 그냥 K라고 말한다.
“아하! RT-PCR용 프라이머 디자인 primer design 말하시는 건가요? 그럼 교수님은 RNA가 얼마나 존재하는지 알아보고 싶으신 거군요?” 초이가 조금은 알겠다는 듯이 웃는다.
“당연하지!” 민은 재빨리 대꾸한다.
“RT-PCR은 역전사 중합효소 연쇄 반응이라고 하는데요. 이를 위해 사용하는 프라이머 디자인은 증폭 과정의 특이성, 효율성 및 성공에 직접적인 영향을 미치기 때문에 중요한 단계에라고 할 수 있어요.
특히 선배님이 보고자 하는 표적 RNA 염기서열을 정확하게 효과적으로 증폭하려면 몇 가지 고려해야 해요.”
“뭐가 그리 복잡하고 고려할 게 많아? 민이 다시한번 얼굴을 찡그린다.
“처음만 그렇지, 일단 해 보시면, 별 거 아니에요.” “선배님도 잘 아시겠지만요?”
“…….” 민은 살짝 한숨을 쉰다.
“RT-PC R은 역전사(RNA를 상보적인 DNA, cDNA로 전환하는 과정)와 일반적으로 많이 사용하는 PCR을 결합하여 특정 RNA 서열을 증폭하는 과정이에요. RT-PCR용 프라이머 디자인에는 몇 가지 중요한 단계가 있어요. 바로 표적 선택, primer design 및 검증이에요”
primer design 단계
1. 표적 (타겟) 선정하기
첫 번째 단계로 증폭하고자 하는 표적 RNA 서열을 선택해야 해요. 이를 위해서는 표적 시퀀스의 길이, 게놈 내 고유성을 파악하면 좋겠죠.
2. 프라이머 디자인 하기
a. 정방향 (forward) 및 역방향(reverse) 프라이머 선택
정방향 프라이머는 표적 RNA로부터 합성된 상보적 DNA(cDNA) 가닥에 결합하는 반면, 역방향 프라이머는 증폭을 시작하기 위해 상보적 가닥에 결합해요. 두 프라이머는 균형 잡힌 결합을 위해 비슷한 용융 온도(Tm) 및 GC 함량이 되는 게 좋아요. 5-10°C의 Tm 차이가 허용되며 GC 함량은 대개 40-60% 사이로 해요.
b. 프라이머 길이 결정하기
프라이머의 길이는 대개 18-30개 뉴클레오티드 사이로 사용하구요, 저는 주로 18-20개 정도의 뉴클레오티드로 해요. 아까도 말했지만, 너무 긴 프라이머는 더 나은 특이성을 주지만, 증폭 효율이 감소될 수 있거든요. 그렇다고, 너무 짧은 프라이머 길이로 할 경우에는 비특이적 증폭 가능성이 높아져요. 한 마디로 잡다한 증폭 산물이 생기는 거죠.
“초이야, 그건 지난번에 얘기했잖아! 같은 얘길 몇 번 하는 거야?” 민은 살짝 짜증 섞인 목소리다.
“네, 선배님, 그래도 전체적으로 설명드리는 게…”
“알았어, 알았으니까, 계속해 봐.”
c. 프라이머 자체 상보성 및 2차 구조 방지
프라이머 자체 상보성은 프라이머-다이머가 만들어져 비특이적 증폭 반응이 일어날 수 있어요. 또한 프라이머 내의 2차 구조는 프라이머가 주형에 결합하는 것을 방해할 수 있거든요. 그래서 Primer3 및 OligoAnalyzer와 같은 프라이머 디자인 프로그램을 사용해서 잠재적인 2차 구조를 고려해서 디자인 하죠.
“저는 주로 Primer-BLAST를 사용해요. 공짜거든요. 하핫” 초이는 웃고는 잠시 숨을 돌린다.
Primer-BLAST 링크는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi 에요
d. 프라이머 특이성 확인하기
디자인한 프라이머가 표적 서열에 특이적으로 결합하고 의도하지 않은 서열의 증폭을 피하도록 하는 것이 중요해요. 저는 NCBI의 BLAST를 사용해서 표적 서열 및 전체 게놈에 대한 프라이머 특이성을 확인해요.
3. 프라이머 검증하기
a. 프라이머-프라이머 상호 작용 분석
실험 검증 전에 Primer-BLAST와 같은 소프트웨어 도구를 사용하여 정방향 및 역방향 프라이머 간의 잠재적인 상호 작용을 분석하는 것이 좋아요. 이 분석으로 프라이머가 프라이머 다이머를 형성하지 않거나 강한 헤어핀 구조를 생성하지 않는 프라이머를 확인해 볼 수 있거든요.
b. 실험으로 검증하기
프라이머가 in silico 분석을 통과하면 실험으로 검증해야 해요. 다시 말해, 표적 RNA 샘플과 디자인한 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 실행하는 거죠. 증폭 산물은 겔 전기영동 또는 시퀀싱(서열분석하기, sequencing)과 같은 방법을 사용해서 원하는 PCR 증폭 산물의 크기와 비특이적 산물이 없는지 확인해야 해요.
c. 최적화 및 문제 해결하기
초기 실험에서 결과가 만족스럽지 않으면 최적화 과정이 필요해요. 예를 들면, 프라이머 농도 조정, 어닐링(annealing) 온도 변화 등이죠. 사실 이 과정은 체계적으로 수행해야 하고, 한 번에 하나의 매개변수를 테스트하여 문제의 원인을 찾아 내서 해결해야 한답니다.
초이는 잠시 숨을 들이쉬며,
” 다시말씀 드리면, RT-PCR을 위한 프라이머 설계에서 중요한 단계로 표적 선택, 프라이머 설계 및 검증이 있어요. 특히 표적 길이, 프라이머의 Tm, GC 함량, 자기 상보성 및 특이성과 같은 특성을 잘 고려하는 게 중요해요. 아까 말했던 Primer3와 같은 소프트웨어 도구를 사용해서 in silico 분석을 하면 프라이머 선별 과정에 많은 도움이 되지만, 사실 실험을 통해 프라이머의 효율성과 특이성을 확인하는 검증 작업이 중요한 것 같아요. 어차피 실험으로 확인해야 하는 거죠. 표적 RNA 서열을 정확하고 효과적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이렇게 한번 디자인해 두면, 두고 두고 사용할 수 있죠. 하핫 ” 말했다.
“알았어, 알았으니까,” 민은 이제 초이가 긴긴 설명은 그만하고 어서 K가 말한 프라이머 서열이 뭔지나 알고 싶은 눈치다.
(계속……)