프라이머 primer와 관련하여 종종 생기는 궁금증들을 Q&A로 정리해 보았다.
1. 공통 또는 범용 프라이머 (Universal primers)란?
공통 범용 프라이머 universal primers는 복제와 같은 분자 생물학 기술에 일반적으로 사용되는 짧은 DNA 서열을 말한다. 이 프라이머는 높은 수준의 특이성을 가지며 DNA 주형의 보존된 영역에 결합하도록 설계되었다. 일반적으로 많이 사용되는 세 가지 범용 프라이머는 T7, SP6 및 M13이다.
T7 및 SP6 프라이머는 이들이 파생된 박테리오파지 RNA 중합효소의 이름을 따서 지어졌다 . M13 프라이머는 M13 박테리오파지에서 파생되며 일반적으로 DNA 시퀀싱 및 클로닝에 사용한다.
전반적으로 T7, SP6 및 M13 프라이머는 복제 및 기타 응용 분야를 위한 분자 생물학 연구에 사용되는 필수 범용 프라이머다.
특정 PCR 산물을 클로닝 벡터에 삽입해서 시퀀싱 하는 경우에 PCR 산물 증폭에 사용했던 프라이머가 아닌 벡터에 포함되어 있는 프로모터 서열인 T7, SP6, M13 등을 프라이머로 사용할 수 있다. 초기에 사용한 PCR 프라이머 대신에 공통 프라이머를 사용하면 시퀀싱 초기에 읽지 못하는 10-50 염기 서열을 읽을 수 있다는 장점이 있다.
아래 링크는 마크로젠 Macrogen 사에서 제공하는 범용 프라이머 서열이다.
https://dna.macrogen.com/resources/order_guide/eng/Macrogen_Universal_Primer_List.pdf
2. 프라이머 primer 보관은 어떻게 할까?
합성된 프라이머는 대개 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 기술이 사용된다. 합성된 프라이머는 일반적으로 약 10 μM의 농도로 Tris EDTA (TE)버퍼 또는 물과 같은 멸균된 뉴클레아제가 없는 용액에 녹여 보관할 수 있다. 프라이머는 동결-해동 주기를 최소화하기 위해 작은 일회용 튜브-대개 1.5 mL 멸균 튜브-에 분주하고 안정성을 유지하기 위해 -20°C 또는 -80°C에서 보관한다.
필자의 경우는 일반적으로 농축 프라이머 용액은 5 mM Tris (pH 7.5)에 녹여 -20도 냉동 보관하며, 실제 PCR에 사용하는 작용 프라이머 용액 working primer solution은 10 pmol/μl 로 소량씩 분주하여 -20도 냉동고에 보관하여 사용한다. 대개 프라이머 합성 튜브에 넣어야 할 용액의 부피가 명시되어 있다 (대개 100pmol/ul).
3. 특정 유전자를 클로닝 cloning 할 경우 프라이머는?
예를 들어 TP53 유전자의 단백질을 만들 수 있는 mRNA를 주형으로 cDNA를 만들어 클로닝 할 경우에는 대개 포유류 세포에서 단백질로 발현시키려는 경우가 많기 때문에 이를 위해서는 ATG 라는 시작 코돈(codon)과 TAA 종결 코돈을 포함하는 프라이머를 디자인해야 할 것이다.
TP53 유전자를 복제하기 위한 프라이머를 설계하려면 특정 서열과 원하는 클로닝 전략을 신중하게 접근해야 한다. 분자 생물학에서 TP53 유전자 클로닝용 프라이머를 디자인하는 방법을 생각해 보자.
a. TP53 유전자 서열을 검색해서 확보하기: NCBI GenBank 같은 데이터베이스에서 TP53 유전자를 검색해서 서열을 확보한다. 클로닝하고자 하는 transcript variant 또는 isoform을 잘 확인하여 선별하자.
b. 클로닝 전략 세우기: PCR 증폭, 제한 효소 절단 또는 게이트웨이 클로닝과 같이 어떻게 클로닝할 것인지결정하자.
c. 클로닝하고자 표적하는 부분을 선택하자: 클로닝하려는 TP53 유전자의 특정 영역을 정한다. 예를 들어 전체 코딩 서열 또는 특정 엑손 exon 또는 프로모터 promoter 영역이 될 수 있다. mRNA 전사를 거쳐 단백질용 클로닝인지 혹은 프로모터 분석 용인지에 따라 다르다.
d. 프라이머 디자인 시 고려 할 점들:
- 길이: 프라이머는 일반적으로 18-25개, 일반적으로 사용되는 길이는 20개 뉴클레오티드다.
- GC 함량: 최적의 프라이머 안정성 및 어닐링을 보장하기 위해 40-60%의 GC 함량이 적절하다.
- 용융 온도(Melting temperature, Tm): 프라이머 디자인 소프트웨어를 사용하여 프라이머의 Tm을 계산한다. Tm은 PCR 동안 효율적인 어닐링을 촉진하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머 모두에 대해 유사해야 한다.
- 자가 상보성 방지: 2차 구조를 예측하는 소프트웨어 도구를 사용하여 헤어핀 구조 및 프라이머-다이머 형성을 확인한다.
- 다른 유전자와의 상동성 방지: BLAST 를 사용하여 프라이머가 다른 유전자 또는 게놈 영역과 상당한 상동성을 갖지 않도록 한다.
e. 프라이머 디자인
- Forward 프라이머: 대상 서열의 상위 영역에 어닐링하는 Forward 프라이머를 디자인한다. 프라이머의 5′ 말단에 제한 효소 부위(필요한 경우) 또는 기타 필요한 변형을 포함시킬 수 있다.
- Reverse 프라이머: 표적 서열의 하위 영역에 어닐링하는 역방향 프라이머를 제작한다. 필요할 경우 제한 효소 부위 또는 다운스트림 클로닝 목적을 위한 변형을 포함시킬 수 있다.
f. 프라이머 검증 및 주문
- 프라이머 특이성 확인: BLAST를 사용하여 TP53 유전자 서열에 대한 프라이머의 특이성을 확인하고 게놈의 다른 의도하지 않은 영역을 증폭하지 않는지 확인한다.
- 프라이머 효율: 프라이머 설계 소프트웨어를 사용하여 예측된 프라이머 효율을 고려한다. 클로닝 실험의 성공률을 높이기 위해 효율이 높은 프라이머를 사용해야 한다.
- 프라이머 주문: 프라이머가 설계되고 검증되면 평판이 좋은 프라이머 합성 서비스 제공업체에 주문하자.
프라이머 디자인은 추구하는 연구 목표에 부합하는지 예를 든 TP53 유전자 클로닝에 대한 전문 지식이 있는 관련 문헌 또는 교수님, 동료와 상의하고 피드백을 얻자.